Nilflughunde sind wie ihre Verwandten, die Fledermäuse, nachtaktiv und schlafen tagsüber kopfüber hängend in Höhlen und Ruinen, dicht gedrängt in Gruppen mit bis zu über 2.000 Tieren. Während andere Flughunde Bäume zum Schlafen aufsuchen, können Nilflughunde lichtlose Quartiere nutzen. Sie orientieren sich in völliger Dunkelheit durch Echoortung. Nach Sonnenuntergang fliegen sie zur Nahrungssuche aus und orientieren sich mit ihren Nachtsichtaugen. Ihre Lieblingsspeise, den Saft überreifer Früchte, und Nektar finden sie mit dem Geruchssinn. Nach den Mahlzeiten lecken sich die Tiere ausgiebig. Beim Besuch von Blüten tragen sie Pollen weiter und befruchten damit die nächste Blüte. Sie sind also wichtige Blütenbestäuber.